Entre otros acuerdos, relacionados con la todavía reconquista, como fue el reconocimiento del derecho exclusivo de Portugal a continuar la reconquista del reino de Fez en Africa, la firma del tratado fue fundamental para el futuro de ambos reinos, puesto que  los distintos territorios del Atlántico quedaron distribuidos desde entonces de la siguiente manera: 
Portugal mantiene el control sobre sus posesiones de Guinea, la Mina de Oro, Madeira, las Azores, Flores y Cabo Verde. .
Castilla obtiene el control sobre las islas Canarias.

El papa Sixto IV, con la bula Aeternis Regís de 1481, confirmó la validez de lo acordado en el Tratado, en cuanto al reparto de los territorios atlánticos entre los reinos de Portugal y Castilla. De esa manera, con total exclusividad, Portugal fue avanzando hacia el sur bordeando la costa africana a la búsqueda del otro camino hacia oriente. A Castilla el destino le reservaba encabezar otra gesta más allá de la Mar Océana, hacia el oeste.

En abril de 1480, el rey Alfonso V envió instrucciones para ahogar a los marineros de todos los barcos no portugueses que fueran interceptados en las aguas asignadas a Portugal. 
Mientras tanto, los Reyes Católicos hicieron cumplir el Tratado de Alcáçobas a sus súbditos. Los que poseían licencias del rey de Portugal pudieron seguir comerciando en Guinea sin problemas. Pero no todos los que navegaban las solicitaron, y a partir del año 1480 hubo muchas expediciones ilegales y casos de piratería. De hecho, en 1489 los Reyes estimaron necesario recordar la prohibición de entrar en las aguas y tierras de Portugal y de capturar barcos portugueses.